三倍体牡蛎的诱导方法

人气 1384   2005-5-23 10:10

牡蛎卵子细胞成熟分裂的过程可以通过物理、化学或生物的方法进行控制,使卵子保留第一或第二极体,卵子包含的两套染色体组与精子的一套染色体组结合,得到含有三套染色体组的合子,进而发育成三倍体牡蛎。

通过抑制第一极体途径获得的三倍体,由于染色体在第二次成熟分裂过程中分离的复杂化,三倍体率、胚胎的孵化率和幼虫的成活率都很低,不适合于大规模生产。因此,目前三倍体的诱导多采用抑制第二极体的方法。

1)常用的物理方法有温度休克和静水压等。 温度休克包括热休克和冷休克,主要是引起细胞内酶构型的变化,不利于酶促反应,导致细胞分裂时形成纺锤丝所需ATP的供应途径受阻,使细胞不能随染色体的加倍而分裂,从而形成三倍体。使用的温度一般是在该物种生存温度范围的上下限附近,如利用4-5℃低温抑制大连湾牡蛎第二极体排出,幼贝的三倍体率为64%,这种方法比较节省,效果也较好。

利用水静压设备对受精卵施加一定的压力,主要是抑制纺锤体的微丝和微管的形成,中止染色体的移动,从而抑制细胞的分裂,阻止了极体的排出。对太平洋牡蛎采用200-250kg/cm2的压力,处理受精卵10min左右,三倍体率为57%。

2)化学方法 常用的化学药品主要有:细胞松弛素B(简称CB)、6-二甲氨基嘌呤(简称6-DMAP)等。

CB是真菌的一类代谢产物,具有抑制胞质分裂过程的效应。在细胞分裂过程中,胞质分裂沟的形成,是细胞质周边一个由微丝构成的“收缩环”紧缩的结果,最终导致两个子细胞分开。CB具有特异性地破坏微丝的作用,使“收缩环”解体,通过阻止分裂沟的形成,抑制细胞质分裂,阻止极体的排出。但CB并不影响细胞核的分裂和染色体的分离。有效浓度为0.2-1.0mg/L,一般溶解在等量的二甲亚砜中使用。CB是诱导贝类多倍体的有效药物,在所有已开展的贝类多倍体研究中被广泛使用。但CB是一种剧毒化学药物,经CB处理后的胚胎死亡率很高。

6-DMAP是嘌呤霉素的一种类似物,主要作用是通过对磷酸化激酶的抑制,抑制一系列有磷酸激酶参与的生化反应和细胞功能,如抑制极体的形成和释放等。太平洋牡蛎卵子受精后15分钟,用450?M的6-DMAP持续处理10分钟,三倍体率为85%,D型幼虫率为64%。由于6-DMAP低毒、高效、价廉,处理后不需洗卵去除药液可直接入池孵化,孵化率达70%左右,幼虫发育及存活率与二倍体对照组无明显差异,最近在贝类多倍体诱导中代替CB被广泛应用。有效使用浓度为200-600?M。

3)生物方法 通过四倍体与二倍体杂交得到了100%的三倍体太平洋牡蛎,无论是正反交,得到的后代均是三倍体。这项研究结果表明,在贝类中采用四倍体与二倍体杂交是生产三倍体的最佳途径。

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